Pengurutan protein atau sekuensing protein adalah penentuan urutan asam amino dari suatu protein atau peptida. Metode yang biasa digunakan adalah degradasi Edman dan spektrometri massa. Spektrometri massa lebih sering digunakan untuk sekuensing protein tetapi metode degradasi Edman juga sering digunakan untuk menentukan ujung-N (N-terminus) protein.
Menentukan komposisi asam amino dan ujung-N
Sebelum sekuensing dilakukan, terkadang perlu untuk mengetahui asam amino yang terkandung di dalam protein tersebut. Hal ini dilakukan untuk membantu mendeteksi kesalahan pada sekuensing dan terkadang untuk menentukan enzim yang akan digunakan. Mula-mula, protein akan dihidrolisis dengan cara dipanaskan dalam larutan asam klorida. Lalu, asam amino dipisahkan dengan metode kromatografi dan diturunkan untuk kemudian diidentifikasi.
Penentuan ujung-N dari suatu peptida juga dapat dilakukan untuk membantu penyusunan fragmen peptida menjadi satu rantai utuh. Pertama, ujung-N peptida akan ditandai dengan reagen tertentu. Reagen tersebut akan bereaksi dengan gugus amina untuk menghasilkan derivat yang berwarna. Reagen yang sering digunakan adalah reagen Sanger. Kemudian, protein akan dihidrolisis dan hasilnya ditentukan dengan cara kromatografi. Karena reagen tadi menghasilkan derivat berwarna, analisis hanya perlu dilakukan secara kualitatif dengan kromatografi lapisan tipis atau kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).
Degradasi Edman
Pada degradasi Edman, residu pada ujung-N protein akan dipotong dengan bantuan fenil isotiosianat. Potongan asam amino ini kemudian dilarutkan dengan pelarut organik dan didentifikasi dengan menggunaan kromatografi atau elektroforesis. Proses ini lalu dapat diulangi lagi untuk menentukan asam amino yang berikutnya. Kelemahan metode ini adalah bahwa polipeptida yang disekuensing dengan metode ini tidak dapat lebih panjang dari 50-70 asam amino. Hal ini dapat disiasati dengan memecah peptida yang besar menjadi peptida-peptida kecil sebelum diurutkan. Kelemahan lainnya adalah bahwa metode ini tidak dapat dilakukan jika ujung-N protein telah dimodifikasi.
Degradasi Edman juga dapat dilakukan secara otomatis dengan menggunakan sekuenser protein[1]
Identifikasi dengan spektrometri massa
Pengurutan protein juga dapat dilakukan dengan spektrometri massa yang dapat mengukur massa molekul secara tepat. Peptida yang ingin diurutkan akan dipecah menggunakan enzim protease tertentu untuk menghasilkan potongan peptida. Enzim yang banyak digunakan adalah tripsin, yang mampu memutus ujung-C terminal dari residu lisina dan arginina secara selektif. Peptida yang dihasilkan kemudian dimasukkkan ke dalam matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight spectrometry (spektrometri ionisasi desorpsi laser dengan bantuan matriks-waktu terbang/MALDI-TOF) dan dipecah secara ionisasi untuk mendapatkan informasi tentang urutan peptida tersebut. Informasi yang didapatkan berupa massa dari ion peptida yang dihasilkan kemudian dapat dicocokkan dengan basis data rujukan yang didasarkan pada data asam nukleat untuk menentukan sekuens protein asalnya. Analisis tersebut dapat dilakukan dengan bantuan suatu perangkat lunak. Perangkat lunak tersebut akan menghasilkan laporan tentang sekuens protein yang dianalisis.[2][3]
Memprediksi dari sekuens DNA/RNA
Secara biologis, protein dihasilkan dari translasi RNA duta (mRNA) dan urutannya diturunkan dari urutan kodon pada mRNA tersebut. mRNA itu sendiri berasal dari transkripsi DNA. Proses ini dapat dipelajari untuk membuat algoritma komputer yang dapat memprediksi urutan protein dari urutan DNA, misalnya dari hasil pengurutan keseluruhan genom. Algoritma ini telah digunakan untuk membuat basis data besar berisi urutan-urutan protein yang dapat digunakan untuk proses identifikasi dengan spektrometri massa.
Lihat pula
Referensi
- ↑ Edman P, Begg G (Maret 1967). "A protein sequenator". Eur. J. Biochem. 1 (1): 80–91. doi:10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x. PMID 6059350.
{{cite journal}}: Pemeliharaan CS1: Tanggal diterjemahkan otomatis (link) - ↑ Shevchenko A, Tomas H, Havlis J, Olsen JV, Mann M (2006). "In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes". Nature Protocols. 1 (6): 2856–60. doi:10.1038/nprot.2006.468. PMID 17406544.
- ↑ Gundry RL, White MY, Murray CI, Kane LA, Fu Q, Stanley BA, Van Eyk JE (Oktober 2009). "Preparation of proteins and peptides for mass spectrometry analysis in a bottom-up proteomics workflow". Current Protocols in Molecular Biology. Chapter 10: Unit10.25. doi:10.1002/0471142727.mb1025s88. PMC 2905857. PMID 19816929.
{{cite journal}}: Pemeliharaan CS1: Tanggal diterjemahkan otomatis (link)
| Internasional | |
|---|---|
| Nasional | |
| Lain-lain | |
