Cerita berfokus kepada kisah masa-masa muda nenek moyang Desmond, Ezio Auditore da Firenze, yang hidup pada masa Renaisans. Kisahnya bermula ketika keluarganya dikhianati oleh teman dekat ayahnya dan Ezio bersumpah untuk membalaskan dendam ayahnya. Seiring berjalannya cerita, Ezio mengetahui kalau ayahnya adalah seorang assassin dan teman ayahnya telah dipengaruhi oleh kelompok rival assassin, Ksatria templar. Ia pun bersumpah untuk menghabisi Ksatria Templar sampai ke akarnya.
