Polimorfisme Panjang Berkas Restriksi (bahasa Inggris: Restriction Fragment Length Polymorphism/RFLP) merupakan penanda molekul yang pertama kali ditemukan dan digunakan. Penggunaannya dimungkinkan semenjak orang menemukan enzim endonuklease restriksi (RE), suatu kelas enzim yang mampu mengenal dan memotong seurutan pendek basa DNA (biasanya 4-6 urutan basa). Enzim ini dihasilkan oleh bakteri dan dinamakan menurut spesies bakteri yang menghasilkannya. Contoh:
- EcoRI adalah enzim RE yang dihasilkan dari bakteri Escherichia coli strain RI (baca: R satu)
- BamHIII diperoleh dari bakteri Bacillus americanus strain HIII (H tiga).
RFLP bersifat kodominan, cukup berlimpah, serta frekuensi polimorfismenya tinggi. Penanda ini mudah dipetakan dalam peta genetik dan bersifat stabil (tidak mudah berubah hasilnya bila diulang). Penanda ini juga tidak spesifik spesies, karena bukan berbasis PCR, sehingga hasilnya bisa digunakan untuk perbandingan peta genetik spesies-spesies yang berbeda-beda. Kelemahannya, penanda ini memerlukan DNA dalam jumlah besar, memakan waktu lama (memerlukan waktu tiga hari), serta melibatkan penggunaan pelabelan isotop radioaktif pada teknik yang pertama kali digunakan. Kelemahan yang terakhir ini dapat diatasi setelah ditemukan teknik tanpa radioaktif.